Микроклональное размножение. Оборудование лаборатории. Ламинарный бокс и работа с ним

Здравствуйте! С вами Сергей, и после короткого перерыва предлагаю вернуться к теме микроклонального размножения растений. На портале «Сити-фермер» уже достаточно много статей на эту тему. И как я говорил раньше, начинали мы с общих моментов, с намерением в будущем углубиться в каждый отдельный аспект клонирования растений.

Как раз в этой статье я планирую полнее раскрыть тему использования ламинарных боксов при микроклональном размножении растений. Ранее я уже рассказывал, что одним из ключевых факторов успеха при клонировании растений является фактор соблюдения стерильности. Питательная среда, на которой происходит культивация эксплантов, содержит сахарозу, гормоны и удобрения. И такая смесь очень хорошо подходит не только для роста растений. На ней будут отлично себя чувствовать и патогенные грибы, и бактерии — вредители растений. Если на каком-то этапе клонирования питательная среда будет инфицирована патогенами, то это приведёт к гибели эксплантов и потерям — как материальным, так и к потерям времени.

Споры бактерий и грибов постоянно присутствуют в окружающей нас среде. Они могут находиться на поверхности предметов, летать в воздухе, быть на наших руках и инструментах. И одна из ключевых задач при микроклональном размножении — не допустить попадания этих спор в контейнеры с клонируемыми растениями.

Человечество научилось решать эту проблему. Когда мы говорим о стерильности в отношении пространства, то подразумеваем два основных вида обеспечения этой стерильности — «чистые помещения» и «чистые зоны». Возможно, вы видели «чистые помещения» по телевизору. Довольно много сюжетов с такими пространствами выходило в период пика пандемии. Такие помещения максимально изолируют от внешнего пространства. Приток и вытяжка воздуха осуществляются по специальной технологии, воздух проходит многоступенчатую систему фильтрации и обеззараживания. Внутри самих помещений устанавливаются дополнительные фильтры и другие средства дезинфекции — форсунки с дезинфицирующим раствором, ультрафиолетовые лампы, озонаторы. Вход в «чистые помещения» осуществляется через специальный шлюз, а работают в них в полностью герметичных защитных костюмах, чтобы патогены с тела человека не попали на материал, с которым ведётся работа. Постройка «чистых помещений» — очень сложный и ещё более дорогой процесс. Я затрудняюсь назвать сумму, но, думаю, стоимость «чистого помещения» минимального размера обойдётся в несколько десятков миллионов рублей.

Понятно, что далеко не каждый начинающий сити-фермер может позволить себе такое помещение. Но есть хорошая новость. Для нужд микроклонального размножения есть куда более дешёвое решение — «чистая зона». Суть понятия «чистая зона» заложена в его названии. Это небольшая изолированная зона, в которой мы можем проводить работы в условиях максимальной стерильности. Как раз к «чистым зонам» и относятся ламинарные боксы.

Ламинарный бокс предназначен для создания локальных стерильных условий за счёт использования потока очищенного (ламинарного) воздуха. Под ламинарным потоком понимается равномерный поток воздуха без слоёв и завихрений. Любое разделение потока воздуха на слои или каналы движения может привести к завихрениям, а последние, в свою очередь, могут привести к захвату неочищенного воздуха извне камеры ламинарного бокса и, как следствие, — потере стерильности. Называют это оборудование также ламинарным шкафом, шкафом микробиологической безопасности или на жаргоне микробиологов — просто ламинаром.

Ламинарный бокс представляет собой шкаф с закрытой рабочей зоной. Работа в боксе производится через специальное прямоугольное отверстие, из которого постоянно выдувается стерильный воздух.

Ламинарные боксы бывают трёх классов безопасности. Первый класс — это приборы с минимальным уровнем защиты. Именно в таких боксах проводятся все манипуляции по микроклональному размножению растений.

Работают ламинарные боксы от сети 220 вольт, потребляют от 150 до 1000 Ватт электрической энергии. Выпускаются модели разных размеров, одни устанавливаются на стол, другие имеют собственные ножки. В целом конструкция ламинарного бокса несложная. И при наличии простых инструментов и возможности купить всё необходимое бокс можно изготовить самостоятельно.

Приведу общую комплектацию таких приборов:

Ламинарные боксы изготавливают из разных материалов. Лидеры тут — нержавеющая сталь и сталь, окрашенная полимерно-порошковым способом. Также ламинары производят из пластика и из дерева. На мой взгляд, нержавеющая сталь — самый хороший вариант, но и самый дорогой.

Фильтровальная система у ламинарных боксов может быть разной. Основное отличие — степень глубины фильтрации воздуха. Фильтрация производится через специальные HEPA-фильтры. Этот материал имеет столь маленькие поры, что сквозь них не могут пройти ни споры грибов, ни бактерии, ни вирусы. Стоимость ламинара будет напрямую зависеть от типа и количества фильтров, которые в нём установлены.

Обычно устанавливают не меньше двух фильтров. Первый — фильтр первичной грубой очистки. Он задерживает крупные частицы и защищает основной фильтр от слишком быстрого загрязнения. Первичные фильтры могут быть одноразовыми или многоразовыми. Во втором случае предусмотрена возможность их очистки воздухом или промывка водой. Второй фильтр — основной. Все микрозагрязнения, содержащиеся в воздухе, задерживаются волокнами основного фильтра.

Основных фильтров может быть несколько, с разной степенью очистки. Чем больше фильтров и чем более правильно они подобраны, тем больше будет их срок службы и тем чище будет получаться поток ламинарного воздуха. Основные HEPA-фильтры — расходный материал. У таких фильтров производителем определён срок службы. Понятно, что скорость загрязнения фильтров будет напрямую зависеть от степени загрязнённости воздуха, но часто для каждого фильтра указывается либо объём воздуха, который может через него пройти до замены, либо время работы — то время, когда вентилятор включен и поток воздуха идёт через фильтр. Камера фильтрации всегда имеет съёмную крышку, через которую осуществляется контроль и замена фильтров.

Принцип работы ламинара я опишу ниже. Тут скажу, что вентилятор обеспечивает продувку воздуха через фильтры для его очистки. У HEPA-фильтров есть степень сопротивления. То есть воздух проходит через них только при определённом давлении. Если вентилятор подобран неправильно, то поток воздуха будет или слабым, или чрезмерно сильным. В обоих случаях это нарушит правильную работу ламинарного бокса. В таких условиях внутри ламинара могут создаваться завихрения, которых в норме быть не должно. Эти завихрения могут приводить к захвату неочищенного воздуха из помещения через отверстие рабочего пространства ламинарного шкафа. В некоторых ламинарах устанавливаются вентиляторы, имеющие несколько степеней регулировки скорости вращения. От скорости вращения лопастей вентилятора напрямую зависит скорость ламинарного потока. Обычно по мере загрязнения фильтра его пропускная способность снижается, а вместе с ней падает скорость ламинарного потока. Чтобы избежать завихрений, можно поменять фильтр на новый или увеличить обороты двигателя вентилятора и немного сэкономить на фильтре, заменив его позже.

Свет нужен для работы в ламинарном боксе. Обычно внутрь верхней части рабочего отсека устанавливают люминесцентную или светодиодную лампу. Иногда лампы оснащают диммером, который позволяет регулировать яркость освещения для комфортной работы в разных условиях и с разными тканями растений. Лампы оснащаются выключателями.

Внутренняя дезинфекция бывает нескольких видов. Самый простой и самый часто используемый вариант — кварцевая или ультрафиолетовая лампа. Такая лампа также устанавливается внутри ламинарного бокса, часто рядом с лампой основного освещения и оснащается отдельным выключателем. Обычно кварцевание включают не позже чем за 15 минут до начала работы в ламинарном боксе. Но все работы в боксе проводятся при выключенной УФ-лампе, поскольку ультрафиолет не только убивает микроорганизмы, но и вреден для человека. В зависимости от конкретной области применения в качестве дезинфекции может применяться обработка озоном и распыление дезинфицирующей жидкости. Для нужд микроклонального размножения будет достаточно кварцевой лампы. Многие начинающие микробиологи работают в простых ламинарах, даже без таких ламп.

Когда я узнал, как создаётся стерильность в рабочей камере ламинара, я был сильно удивлён простотой и оригинальностью решения. Ведь для работы ламинарного шкафа не требуется специальная система приточно-вытяжной вентиляции. Его можно установить где угодно. Условно, его можно поставить на улице или в гараже, даже в этих случаях при работе ламинара его камера будет стерильной. Я, конечно, утрирую, и ламинарный бокс должен находиться в отдельном чистом помещении.

При включении вентилятора ламинарного бокса из помещения, в котором установлен прибор, начинает затягиваться воздух. Этот воздух под давлением попадает в камеру фильтрации с установленными фильтрами. Камера фильтрации должна быть абсолютно герметична. Весь воздух должен проходить только сквозь фильтры. Для герметизации камеры фильтрации и других деталей ламинарного бокса используют силиконовые прокладки или силиконовый герметик. Все частички загрязнений, находящиеся в воздухе, — не важно, пыль ли это или споры, задерживаются на поверхности фильтра. Далее через специальное отверстие чистый воздух устремляется в рабочую зону ламинарного бокса.

Рабочая зона закрыта со всех сторон, кроме передней. Обычно на передней части бокса устанавливается стекло, закрывающее почти всю переднюю стенку. Внизу под стеклом есть небольшое открытое пространство. Оно предназначено для рук микробиолога, работающего внутри ламинара и выдува чистого воздуха. Таким образом, при включённом вентиляторе внутри рабочей камеры ламинара постоянно движется чистый воздух, и он выдувает все загрязнения из рабочей зоны.

В конструкции ламинара важно всё — размер рабочей камеры, пропускная способность фильтра, мощность вентилятора. Все эти параметры подбираются таким образом, чтобы при работе бокса внутри рабочей зоны и на выходе из неё не создавалось завихрений. Завихрения могут захватывать обычный воздух из помещения, и это может привести к заражению питательной среды и гибели эксплантов. Дополнительно можно сказать, что для правильной работы ламинарного бокса важны его геометрия и скорость потока воздуха.

Микробиологическая деятельность — довольно регламентированная область. В зависимости от конкретных видов работ в лабораториях создаются протоколы процедуры выполнения операций. Такие протоколы существуют и для ламинарных боксов. Причём протоколируется всё. Чаще всего разработка таких протоколов проводится самим микробиологом или их группой в рамках работы в конкретной организации.

Приведу самые распространённые области правил:

• Хранение ламинарного бокса между периодами использования. Ламинар работает не всё время, как минимум он отключается на ночь и простаивает в период роста растений, когда работа с открытыми эксплантами не ведётся. Внутри ламинарного бокса проводятся разные процедуры, в результате некоторых из них внутри рабочей зоны появляются загрязнения. И эти загрязнения в дальнейшем могут стать местом развития вредных микроорганизмов. Одной из главных задач микробиолога является соблюдение чистоты внутри рабочего пространства ламинарного бокса. Все загрязнения, возникающие в процессе работы, необходимо сразу убирать. Также с определённой периодичностью нужно проводить дезинфекцию рабочей зоны. Такие дезинфекции проводятся после выполнения каждого блока работ. Например, когда микробиолог приступает к работе с новой партией питательной среды или новой партией эксплантов. Также регламентируются периодические «генеральные уборки» с дополнительной полной дезинфекцией прибора. Рабочая камера неработающего ламинарного бокса должна быть всегда закрыта. При длительном простое прибора предусматривается его консервация. Простым языком: его упаковывают так, чтобы он не пылился и на него не попадали загрязнения и влага из окружающей среды. После периода простоя перед началом работы необходимо проверить работу вентилятора и освещения. Также необходимо проверить наличие фильтров, их состояние и правильность установки.
• Работа в ламинарном потоке воздуха. Это самый большой блок, касающийся применения ламинарного бокса. В зависимости от типа работ применяются разные протоколы. Микроклональное размножение предполагает несколько разных техник от микрочеренкования — когда мы помещаем на питательный субстрат маленькие кусочки растения, содержащие одно междоузлие, до каллуссного или меристемного размножения. Например, при каллусном размножении протокол будет отличаться от микрочеренкования. Несмотря на такие различия, можно привести общие правила работы внутри ламинарного бокса. Все правила строятся вокруг стерильности и максимального снижения вероятности заражения питательной среды патогенами. Общие правила можно сформулировать следующим образом:

1. Перед началом работы микробиолог проверяет исправность ламинара и правильность работы его узлов. Для этого включаются вентилятор и освещение.
2. Следующим этапом микробиолог должен убедиться в отсутствии загрязнений внутри рабочей области и на поверхности прибора.
3. Если ламинарный бокс оснащён кварцевой лампой, то она включается минимум за 15 минут до начала работы. Рекомендуемое время кварцевания составляет от 15 до 30 минут.
4. Если прибор оснащён дополнительной системой дезинфекции, то она проводится согласно инструкции.
5. Следующим этапом микробиолог надевает медицинские перчатки. Перчатки могут быть как стерильными, так и нет, но каждый раз нужно использовать новую пару перчаток. Мне самыми удобными кажутся латексные неопудренные перчатки. Но можно использовать и виниловые, нитриловые или неопреновые перчатки. Основной критерий выбора перчаток — удобство работы. Желательно, чтобы они плотно облегали кисти рук специалиста и их было удобно дезинфицировать. Перед надеванием перчаток кожа рук моется с мылом в проточной воде и после обрабатывается дезинфицирующим средством, содержащим не менее 70% этилового спирта. Для дезинфекции кожи рук лучше использовать спиртосодержащие смеси, в состав которых входят смягчающие косметические компоненты для кожи рук. Спирт сушит кожу рук и при большой интенсивности работы необходимо заботиться о своём здоровье.
6. Перед началом любой работы микробиолог обрабатывает перчатки, надетые на руки, 70%-ным этиловым спиртом. В этом случае используется смесь этилового спирта с водой, без косметических добавок. Руки обрабатываются спиртом перед началом каждой новой процедуры, и каждый раз после того, как специалист прикасался к каким-то нестерильным предметам, например, контейнерам с питательной смесью или инструментам — ножницам, скальпелю и так далее.
7. Все инструменты, которыми проводится работа внутри ламинарного бокса, должны быть стерилизованы. Сделать это можно разными способами. Один из самых оптимальных — использование стерилизационного жарочного шкафа. В нём инструменты подвергаются воздействию высокой температуры, не совместимой ни с какой жизнью.
8. В ходе работы микробиологу требуется также стерилизовать инструменты, в основном это пинцет и скальпель. Они дезинфицируются каждый раз при начале работы с новыми тканями растения. Такая стерилизация может проводиться двумя способами. Первый — использование компактного жарочного шкафа. Представляет из себя что-то вроде тигля с самостоятельным нагревом. Он располагается внутри ламинара и во время работы постоянно включён. Микробиолог просто опускает в него инструменты и под действием очень высокой температуры они дезинфицируются. Второй способ проще и дешевле в реализации. Сначала инструмент протирается салфеткой, обильно смоченной 70%-ным спиртом. Далее, пока спирт не высох, инструмент помещается в пламя спиртовой горелки и выдерживается в нём около 3–7 секунд, пока спирт с поверхности обрабатываемого предмета не сгорит полностью. Затем инструмент снова протирается спиртом. После этого обработанным таким образом инструментом можно работать с растениями и питательной средой.
9. Иногда внутрь рабочей области ламинарного бокса необходимо поместить другое оборудование, например стереомикроскоп. Понадобиться это может, например, при работе с меристемой растения. Меристема — это относительно маленькая ткань растений, состоящая из специализированных клеток роста. Находится она на самом кончике побега и обычно окружена маленькими молодыми листочками и их зародышами. Меристема очень мала, и работать без микроскопа с ней невозможно. Всё, что попадает в рабочую зону ламинарного потока, по возможности должно быть продезинфицировано любыми возможными способами. Если предметы выдерживают термическую обработку, их нужно прогревать в жарочных шкафах. Во всех остальных случаях используется спирт, кварцевание и очистка ламинарным потоком. Например, микроскоп необходимо протереть салфеткой, смоченной спиртом. Особое внимание следует уделить предметному столу микроскопа и окулярам над ним. Но нужно иметь в виду, что спирт может быть вреден для оптики микроскопа. Далее микроскоп помещается внутрь рабочей зоны ламинарного шкафа, и в ней включается кварцевая лампа. Для надёжности микроскоп дополнительно можно расположить так, чтобы УФ-свет попадал на предметный стол микроскопа и ту зону, которая будет ближе всего к растению. Сначала предметы обрабатываются кварцем при выключенном вентиляторе. Обработка длится не менее 15 минут. После включается вентилятор, а дезинфицируемый предмет помещается в центр ламинарного потока. Обработку проводят не менее 5 минут с включённым кварцем и вентилятором.

• Правильная подготовка — залог успеха. Ламинарный поток не обеспечивает полной гарантированной стерильности. Одиночные споры всё же могут оказаться в рабочей зоне и заразить контейнер с питательной средой. Для того чтобы это не произошло, нужно максимально сократить то время, в которое контейнер с питательной средой открыт, а очищенная ткань растения находится в потоке воздуха. То есть все манипуляции с открытой питательной средой и эксплантами должны проводиться максимально быстро. Чтобы это обеспечить, нужно каждый раз точно понимать, какие шаги нужно выполнить, какая будет у них последовательность и что понадобится для этой конкретной процедуры. Например, нам нужно разрезать ткань растения и поместить её на питательную среду для дальнейшей культивации. Для этого нам понадобятся стерильные закрытые контейнеры с питательной средой, само растение, скальпель, пинцет, спирт и спиртовая горелка. Всё это необходимо поместить в ламинар. Контейнеры с питательной средой необходимо протереть спиртом. Для удобства работы скальпель и пинцет рабочими областями опускаются в ёмкость со спиртом и хранятся там всё время, пока не используются. Не стоит открывать контейнеры с питательной средой до того, как вы будете готовы помещать на неё экспланты.

Прядок действий будет примерно такой. Достаём пинцет из спирта и обжигаем его в пламени горелки. Протираем спиртом и переносим пинцетом растение на стерильный предметный стол или другую поверхность, на которой будем разрезать растение. О дезинфекции этой поверхности мы должны позаботиться заранее. Далее достаём скальпель из спирта, помещаем его в пламя горелки и спустя несколько секунд протираем спиртом.

От растения отрезаем такое количество эксплантов, которое влезет в один контейнер. Мы не разрезаем всё растение сразу. Во-первых, место среза — открытая рана. Срез очень быстро окисляется на воздухе, особенно в движущемся ламинарном потоке воздуха. Во-вторых, если на срез попадёт патоген, то он гарантированно заразит эксплант, а вместе с ним всю питательную среду и другие растения в контейнере. Контейнер придётся выбросить. Если же патоген попадает на внешнюю часть растения, например на поверхность листа, то вероятность его прорастания немного снижается, но всё равно остаётся довольно высокой. Берём контейнер, протираем его поверхность и руки спиртом, даём последнему немного испариться и очень аккуратно, короткими плавными движениями открываем крышку контейнера.

Следующим этапом помещаем в контейнер на питательную среду наши нарезанные кусочки растения. Чем быстрее и плавнее произойдёт эта операция, тем меньше вероятность контаминации питательной среды. Внутри ламинарного бокса лучше не делать резких движений и ничем не трясти. При таких действиях с рук одежды или инструментов могут оторваться частички загрязнений, в которых могут находиться споры патогенов. Конечно, такие загрязнения попадают в ламинарный поток и выдуваются наружу из ламинара, но есть вероятность, что какие-то загрязнения могут попасть и на питательную среду или растения, находящиеся внутри ламинарного бокса. После того как все растения оказались в контейнере, аккуратно, но плотно закрываем его крышкой. Процедура повторяется снова, пока все контейнеры не будут заполнены эксплантами. Пока идёт работа внутри ламинара, контейнеры, заполненные растениями, по возможности остаются внутри бокса. Если выставлять каждый контейнер наружу по одному, то это тоже очень сильно увеличит риск контаминации. Только по завершении работы, заполненные контейнеры выставляются на стеллажи с освещением для вегетации.

У человека, комплектующего лабораторию микроклонального размножения растений, есть несколько вариантов обзавестись ламинаром. Перечислю их от менее затратных к более затратным:

• Изготовить самостоятельно. В сети достаточно много информации и инструкций, как это сделать. Фильтры и вентилятор нужно будет купить, на этом сильно не сэкономить. А вот корпус можно выполнить из подручных средств. У самодельных ламинарных шкафов корпус обычно делают из дерева. Это может быть как цельная древесина, так и изделия из неё, например ДСП, ЛДСП, МДФ. Важно окрасить все деревянные поверхности, особенно внутри рабочей камеры. Это позволит проводить более качественную спиртовую дезинфекцию пространства внутри рабочей зоны ламинара. При самостоятельном изготовлении ламинарного бокса очень важно правильно подобрать мощность вентилятора под размер ламинарного шкафа. Этот путь самый малозатратный, но придётся поработать руками самостоятельно.
• Заказать ламинарный бокс у изготовителя-любителя. В сети легко найти информацию с предложениями по изготовлению ламинарных боксов от частных лиц. Такие объявления есть на Авито и других похожих площадках. Этот вариант будет чуть дороже первого, но всё же будет оставаться одним из самых дешёвых. Из плюсов тут ещё можно отметить то, что люди, оказывающие такие услуги, как правило, разбираются в том, что делают, и могут правильно скомпоновать всё необходимое оборудование.
• Приобрести ламинарный бокс, бывший в употреблении. На том же Авито можно найти объявления о продаже ламинарных боксов, как новых, так и бывших в употреблении. Тут всё просто — смотрим подходящие нам модели, задаём вопросы продавцу, едем смотрим товар. У ламинаров, бывших в употреблении, нужно проверять состояние корпуса, его герметичность. Очень важно осмотреть вентилятор и постараться понять его состояние — провести визуальный осмотр, послушать, как работает двигатель. Фильтры в таких ламинарных боксах, скорее всего, придётся поменять. И очень важно до покупки понять, не сняты ли такие фильтры с производства и сможете ли вы их купить, ведь фильтры, как вы помните, необходимо менять.
• Приобрести новый ламинарный бокс. Здесь всё просто — определяемся с необходимыми требованиями и ищем ламинар под эти нужды. Скажу сразу: это самый дорогой вариант.

Если вы ещё не уверены в своих силах, то на старт лучше поискать оптимальный вариант по соотношению цены и качества. Если работа микроклональной лаборатории пойдёт хорошо, то вам в парк понадобится ещё один ламинарный шкаф. И его уже можно будет приобрести с учётом вашего опыта.

Надеюсь, после прочтения данного материала у вас осталось меньше вопросов к выбору ламинарного бокса. А если они возникли, то, как всегда, готов ответить на вопросы в комментариях. Всем продуктивной работы и больших урожаев!