Микроклональное размножение растений. Оборудование лаборатории. Автоклав

Здравствуйте! С вами Сергей, и мы продолжаем разговор о микроклональном размножении растений. Сегодняшняя тема не очень объёмная по информации, зато очень важная. И поговорить сегодня я предлагаю о стерилизации и автоклавах.

Как я уже много раз писал, одним из факторов успеха при микроклональном размножении растений является условие сохранения стерильности среды. Питательная среда, на которой происходит выращивание клонов, состоит из набора различных веществ. В этот набор входят удобрения, фитогормоны, витамины, вспомогательные вещества и сахароза. И на такой питательной среде будут хорошо расти не только растения, но и патогены — бактерии и грибы. И одной из главных задач микробиолога является соблюдение стерильности в местах произрастания клонов, а именно — в контейнерах, колбах и пробирках, в которых происходит размножение растений.

На поверхности окружающих нас предметов и даже в воздухе, которым мы дышим, постоянно находятся бактерии, кусочки грибного мицелия, а также споры грибов и бактерий. При первой возможности эти споры прорастают и начинают осваивать окружающее пространство в поисках пищи. Среди бактерий и грибов огромное количество патогенов — живых существ, питающихся другими живыми существами, вызывающими их болезни и в конечном итоге гибель. В нормальном состоянии всё живое способно противостоять вредному воздействию извне. Для этого у всех, даже у самых простых живых существ, есть система защиты — иммунитет. Взрослые и здоровые растения спокойно противостоят постоянной атаке патогенов. А маленькие или ослабленные растения находятся в постоянной группе риска, и именно к таким растениям относятся наши клоны.

В микроклонировании существует несколько способов размножения растений. Но какой бы способ мы ни выбрали, работать мы всегда будем только с маленьким кусочком растения — микрочеренком или вовсе набором меристемных или калусных клеток. Понятно, что такие маленькие объекты, отделённые от материнского растения, практически лишены защиты и не обладают иммунитетом. Любой патоген, даже одна спора бактерии или гриба, способна убить все растения, находящиеся на питательной среде внутри контейнера. По этой причине для микроклонального размножения растений используют специальные процедуры, а именно — стерилизацию методом автоклавирования.

Люди довольно давно заметили, что высокие температуры губительно воздействуют на всё живое. Ни для кого не секрет, что вся жизнь на нашей планете построена из органических веществ — белков. Большинство белков, из которых состоим и мы с вами, имеют определённый рабочий диапазон температур. И нормальное функционирование живых организмов возможно только в этом диапазоне температур. Например, люди не способны переносить очень низкую или очень высокую температуру. К таким условиям среды мы приспособились по-другому, используя свой интеллект. А вот деревья средней полосы России вполне могут переносить продолжительный зимний холод, растения пустыни — сильную жару и дефицит влаги, для этого у них есть адаптационный механизм. Бактерии и грибы в этом плане ещё более адаптивны и способны переносить неблагоприятные и даже экстремальные условия среды. А ещё в их арсенале есть такой инструмент, как размножение спорами. Про споры стоит сказать отдельно.

Бактерии и грибы способны как к половому, так и к бесполому размножению. Бесполое размножение очень похоже на вегетативное деление растений. Клетка или организм, из них состоящий, делится надвое, или от него отпочковываются небольшие сегменты. Грибы способны размножаться гифами мицелия. Но у бактерий и грибов есть ещё один способ размножения — половой. Или размножение с помощью спор. Споры очень маленькие и очень прочные. Их задача — максимально долго сохранять генетический материал в неблагоприятных условиях, и прорасти, как только условия станут приемлемыми. Оболочки спор настолько хорошо защищают внутреннее содержимое, что споры, побывавшие в открытом космосе, спокойно прорастают в земных условиях. Это свойство спор даже легло в основу одной из теорий возникновения жизни на нашей планете — теории панспермии. Согласно этой теории, жизнь на нашей планете не возникла сама собой, а была занесена на неё из далёких уголков космоса. И такая теория имеет полное право на существование, ведь нам давно известно, что в верхних слоях атмосферы и ближнем космическом пространстве встречаются вполне жизнеспособные споры бактерий и грибов.

Как можно понять из сказанного, споры бактерий и грибов очень жизнеспособны. В отличие от своих взрослых хозяев споры спокойно переносят низкие температуры. Выше у них стойкость и к высокой температуре. Кроме того, споры могут быть невосприимчивы к фунгицидам и антибактериальным средствам. И борьба со спорами в условиях микроклонального размножения растений является одним из ключевых факторов успеха.

На нашей питательной среде, предназначенной для клонирования растений, могут поселиться какие угодно бактерии и грибы. Необязательно они будут являться прямыми патогенами выращиваемых нами растений. Это может быть вполне безобидный штамм микроорганизмов. Но дело в том, что расти этот штамм будет вместе с нашими растениями в замкнутом пространстве. И в эту же среду он будет выделять свои продукты жизнедеятельности, на которых, в свою очередь, могут поселиться другие патогены. В конечном итоге питательная среда станет просто непригодна для жизни растений, и все они погибнут.

Заражение питательной среды патогенами называется контаминацией. Обычно контаминация развивается не сразу. Если в питательную среду попали живые бактерии или грибы, то заражение произойдёт довольно быстро. Патогены могут быть видны невооружённым глазом даже спустя несколько часов после заражения. А если в питательной среде выжили только споры, то их развитие может быть более длительным, и занимать от одного до семи дней. Таким образом может возникнуть ситуация, при которой мы обнаружим заражение среды только спустя несколько дней. И такие заражения — всегда потери для лаборатории. Не важно, на каком этапе вы обнаружили заражение среды. Почти во всех вариантах заражённые контейнеры подлежат утилизации, спасти растения, находящиеся в них, или невозможно, или экономически нецелесообразно. Именно поэтому в микроклональном размножении растений так много внимания уделяют стерилизации питательной среды. Ведь предотвратить потери можно, а вот обратить заражение вспять — нет.

Думаю, многие из вас слышали такой термин из прошлого, как «скороварка». Этот кухонный аксессуар выпускается до сих пор. Скороварка представляет собой толстостенную кастрюлю, из сплава алюминия, крышка которой плотно фиксируется через специальную термостойкую прокладку. Такая фиксация делает скороварку герметичной, а клапан, расположенный в крышке, позволяет удерживать нужное давление. Таким образом внутри скороварки создаётся повышенное давление, а температура кипения воды поднимается. Комбинация высокой температуры и давления ускоряет процесс приготовления пищи и, параллельно, убивает всё живое.

Именно на принципе повышенной температуры и давления основано действие стерилизации внутри автоклава. Дело в том, что именно комбинация высокой температуры и высокого давления способна эффективно разрушать стенки спор бактерий и грибов, делая питательную среду стерильной.

Принцип действия всех автоклавов схож. Внутри герметичной ёмкости разогревается вода. Далее вода превращается в пар, а пар, поскольку ему некуда выходить, начинает перегреваться. За счёт этого внутри автоклава увеличивается давление. А при повышенном давлении можно получать перегретый пар с температурой выше 100 градусов Цельсия. При стерилизации методом автоклавирования ключевое значение приобретает именно повышенное давление.

Многие любители начинают свой путь в микроклональное размножение растений именно со скороварок. Дело в том, что это устройство является первым из доступных, способных обеспечить должный уровень стерильности.

Также начинающему микробиологу могут помочь современные бытовые автоклавы. Выпускают их сейчас довольно много, модели все похожи, отличаются дизайном, внешним видом и материалом изготовления. Продают их для изготовления домашних консервов. Именно в таких автоклавах при повышенной температуре и давлении можно приготовить тушёнку или кабачковую икру, которые могут храниться несколько лет. И в этих же автоклавах можно стерилизовать питательную среду для микроклонального размножения растений.

Бытовые автоклавы отличаются своими размерами. И если вы ещё не решили точно, станете вы микробиологом или нет, бытовой автоклав — компромиссное решение, но не лучшее. Зато, если вы не станете микробиологом, вы всегда сможете готовить консервы в своём автоклаве.

В рамках этой статьи я не вижу смысла рассматривать все существующие виды автоклавов — поверьте, бывают они довольно сложные и очень большие. Некоторые в процессе работы могут наклоняться или вращаться, в других может создаваться избыточное давление в несколько десятков или даже сотен атмосфер.

Для нужд микроклонального размножения нам подойдёт прибор, способный создавать рабочее давление в 1,2 атмосферы, и поддерживать его при температуре 120 градусов Цельсия. Других специальных требований к автоклаву нет. Важным будет наличие автоматики. Современные автоклавы оснащены электронным блоком автоматического управления. С помощью этого блока задаётся программа автоклавирования и весь процесс стерилизации проходит автоматически.

Любая скороварка или автоклав — это предмет повышенной опасности. Перегретый водяной пар имеет сильную разрушающую способность. И при нарушении техники безопасности автоклав может взорваться. Благо, все современные автоклавы, и даже бабушкина скороварка, оснащены системами защиты. В простых устройствах, вроде скороварки, это клапан сброса давления. Клапан регулируется таким образом, что при достижении давлением избыточного значения он открывается и происходит сброс. После того как давление выровняется, клапан закрывается. Более дорогие автоклавы могут иметь несколько степеней защиты, например, параллельно со сбросом давления может происходить отключение нагрева автоклава. В любом случае перед первым использованием автоклава, необходимо проверить все его механические части и внимательно ознакомиться с инструкцией по работе с устройством.

Как вы можете помнить, все манипуляции с растениями при микроклональном размножении проводят в максимально стерильных условиях. Работа ведётся в ламинарном боксе с использованием стерильных инструментов. И часть оборудования и инструментов можно стерилизовать в автоклаве.

Автоклавировать можно всё, что не боится давления и высокой температуры:

• Автоклавирование питательной среды. В микроклональном размножении для создания питательной среды используют так называемые соли или удобрения, сахарозу и фитогормоны. Из всего этого набора нельзя автоклавировать только фитогормоны, поскольку они являются органическими веществами, разрушающимися при высокой температуре и давлении. Удобрения и сахароза автоклавируются при температуре 120 градусов Цельсия и давлении 1,1–1,2 атмосферы.
• Автоклавирование дистиллированной воды. Все питательные среды для нужд микроклонального размножения растений готовятся на дистиллированной воде. Эта вода может производиться самой лабораторией с помощью дистиллятора или приобретаться у сторонних организаций. Не важно, получена вода нами или приобретена на стороне, — она не стерильна. И сама вода тоже может быть источником патогенов. Поэтому вся вода, применяемая для микроклонального размножения, должна стерилизоваться методом автоклавирования.
• Пластиковые контейнеры. Конечно, просто пустые контейнеры никто не стерилизует. Контейнеры я вынес отдельно, поскольку этот пункт очень важен. Выращивание эксплантов на питательной среде проводится как раз внутри пластиковых контейнеров. И это очень удобно. Контейнеры одноразовые, их не нужно мыть или как-то специально подготавливать для использования. Единственное условие — необходимо подобрать контейнеры из подходящего, термостойкого пластика. И нам нужно искать контейнеры из полипропилена, обозначаются они русскими буквами «ПП» или английскими «PP». Полипропилен способен выдерживать температуру до 130 градусов Цельсия. Учитывая, что температура стерилизации составляет 120 градусов, контейнеры из полипропилена — это оптимальный выбор для микроклонального размножения растений. Время стерилизации питательной среды от 15 до 30 минут.
• Инструмент и вспомогательные материалы. В автоклаве можно стерилизовать любой инструмент, которым ведётся работа в лаборатории. Единственное — нужно учитывать, что высокая температура и давление плохо влияют на предметы из металла. Например, скальпели могут быстро тупиться, а шпатели и лопатки могут начать ржаветь. Металлический инструмент, а также материалы, боящиеся влаги, при автоклавировании лучше помещать в герметичную тару. Автоклавировать можно и стеклянные изделия — пробирки, колбы, банки.

При микроклональном размножении растений стандартная процедура автоклавирования происходит при температуре 120 градусов Цельсия и давлении 1,1 атмосферы. Время автоклавирования 30 минут. Увеличение температуры или давления может привести к разрушению и деформации предметов внутри автоклава. Например, при повышенном давлении, скажем, в 1,3–1,5 атмосферы, пластиковые контейнеры могут начать плавиться при более низкой температуре. Это приведёт к их разрушению и потерям на этапе автоклавирования. Обычно автоклавы оснащены датчиками температуры и давления, а также пультом управления, позволяющим менять эти значения.

Более короткое время автоклавирования и температура ниже 120 градусов Цельсия могут не убить все патогены, и наши контейнеры с эксплантами подвергнутся контаминации. Напротив, температура выше 120 градусов и давление выше 1,2 атмосферы, помимо того, что могут разрушить то, что мы стерилизуем, просто приведёт к дополнительным ненужным расходам на электроэнергию и труд.

Отдельно стоит сказать про герметизацию автоклавируемых ёмкостей. Речь тут идёт про контейнеры, колбы и пробирки. Дело в том, что внутри автоклава присутствует высокая температура, пар и давление. При изменении давления и температуры внутри автоклава, происходит изменение давления и температуры внутри закрытых ёмкостей. Одна из частых проблем — открывшиеся пробки колб и пробирок. Иногда такая судьба постигает и контейнеры с питательной средой. Как вы понимаете — всё, что открылось, уже нестерильно, и использовать это нельзя. Проще всего решить проблему с контейнерами, для этого необходимо подобрать ёмкости с качественными, герметичными, хорошо закрывающимися крышками. Иногда может помочь дополнительная упаковка контейнеров в стретч-плёнку. Только стретч-плёнка может быть сделана из разного сырья, в том числе переработанного, и может не выдержать испытание автоклавом. Предварительно её нужно будет проверить на возможность выдерживать нужные нам температуру и давление. Сложнее дела обстоят с колбами и пробирками. Колбы и пробирки для автоклавирования могут закрываться резиновыми или силиконовыми пробками, а также ватными тампонами. При автоклавировании из-за перепадов давления открываются и первые, и вторые. Поэтому те пробирки и колбы, что закрыты ватными пробками дополнительно накрывают бумагой, фольгой или полипропиленом и закрепляют их силиконовыми резинками. Второй вариант — всё та же стретч-плёнка или скотч. Перед использованием, скотч тоже желательно протестировать в автоклаве.

Ещё раз напомню, что автоклав является источником повышенной опасности, соблюдайте технику безопасности при работе с ним. Следующие простые правила помогут вам избежать возможных проблем:

1. Внимательно изучите инструкцию по эксплуатации вашего автоклава. Составьте пошаговую инструкцию и чек-лист работы с автоклавом, поместите эту инструкцию в помещении для автоклавирования на видном месте.
2. Назначьте ответственного за работу с автоклавом. Если в вашей лаборатории трудится больше одного человека, то с автоклавом должен всегда работать один и тот же постоянный сотрудник. Этот принцип позволит избежать многих проблем, в том числе нарушения протокола стерилизации.
3. Соблюдайте протокол стерилизации. Помните, что неправильно проведённая стерилизация может стать причиной заражения питательной среды. Заражение питательной среды — это всегда отложенные во времени потери, по сути — убытки. Чем раньше будет обнаружена контаминация или, например, разгерметизация контейнера, тем меньше потерь понесёт лаборатория микроклонального размножения растений.
4. Проверяйте новые материалы на устойчивость к автоклавированию. Например, если вы приобрели новые пластиковые контейнеры для выращивания клонов, особенно, если это простые пищевые контейнеры, их стоит проверить. Может случиться так, что именно эта партия контейнеров будет немного отличаться от заявленных свойств, например, будет выдерживать меньшую температуру или давление. Если мы сразу заполним такие контейнеры питательной средой и отправим стерилизоваться, то в процессе контейнеры деформируются, питательная среда выльется, и мы потеряем её, контейнеры, а ещё электричество, труд и время. Да и рабочее пространство автоклава придётся отмывать. Новый контейнер логично будет поместить с другой стерилизуемой партией материалов, и посмотреть, как он поведёт себя в условиях повышенной температуры и давления.
5. Никогда не открывайте работающий или горячий автоклав. Обычно, автоклавирование проводят вечером и оставляют автоклав закрытым, остывать до утра. За это время содержимое автоклава успевает остыть, а давление внутри выровняться. Если автоклав открыть сразу, то разность температуры и давления может привести к разгерметизации автоклавируемых ёмкостей — контейнеров, пробирок, колб и банок. В них попадёт внешний воздух, а вместе с ним и потенциальные патогены — споры грибов и бактерий. Обычно в инструкции к автоклаву указано, как правильно и через какой интервал времени его можно открывать. Если таких данных нет, подождите не менее 4–6 часов, прежде чем открыть автоклав после его работы.
6. Подбирайте время работы автоклава в зависимости от его загрузки. Для стерилизации крупных и массивных объектов требуется больше времени, чем для мелких. Так, дистиллированную воду в большой ёмкости следует стерилизовать дольше, чем много маленьких контейнеров с питательной смесью. Учитывайте это при выборе продолжительности автоклавирования.
7. Ведите журнал автоклавирования. Какими бы огромными ни были ваши объёмы производства — всегда ведите журнал автоклавирования. Журнал этот довольно прост и содержит в себе дату стерилизации, время начала и время конца процедуры, информацию о стерилизуемом материале, а также продолжительности и условиях стерилизации. В журнале должна быть графа для прочих заметок. Записывать в эту графу стоит всё, что выходит за рамки стандарта. Например, отключение электричества, раннее открытие автоклава, слишком короткое или слишком долгое время стерилизации или другие непредвиденные события. Ведение такого журнала сильно упрощает работу над ошибками в том случае, если процедура микроклонального размножения пошла не по плану.

Особое внимание следует уделить первой процедуре автоклавирования. Задача первого автоклавирования — убедиться в работоспособности прибора и соблюдении условий стерильности. Сама процедура первого автоклавирования ничем не будет отличаться от последующих. При первом автоклавировании мы стерилизуем несколько контейнеров с питательной средой и оставляем их на свету и при комнатной температуре на 7–10 дней. Если мы всё сделали правильно, то, спустя это время, питательная среда останется чистой и неизменной. Это значит, что стерилизация прошла правильно и наша среда свободна от патогенов. И, как следствие, наш автоклав работает правильно. После такой проверки можно начинать процедуру микроклонального размножения растений. Если же за время проверки среды на ней появились новые образования в виде последовательных «бусинок», «пушка», изменения окраски, то это говорит об её контаминации. Такая среда заражена, и провести размножение растений на ней не получится.

Некоторые микробиологи выдерживают каждую партию питательной среды несколько дней при комнатной температуре для проверки её стерильности. Но по мере наработки опыта эта процедура может опускаться. Скажу сразу: это является нарушением общего протокола микроклонального размножения растений, тут приходится искать компромисс между сроками размножения и себестоимостью итоговой продукции. И каждый раз микробиолог несёт ответственность за принятое решение.

Подводя итог, можно сказать, что автоклав является обязательным оборудованием лаборатории микроклонального размножения растений. Без него добиться успеха в клонировании растений просто невозможно. Никакие другие варианты стерилизации в этом случае не подойдут. При выборе автоклава учитывайте его объём, электрическую мощность, наличие автоматики, и, конечно, ваш бюджет. В этой статье я постарался раскрыть общую информацию касательно автоклавов. В будущих материалах уже опишу подробно стерилизацию в автоклаве на конкретном примере оборудования. Остались вопросы — задавайте в комментариях. Всем больших урожаев!