Здравствуйте, уважаемые посетители портала «Сити-фермер»! С вами Сергей, и я предлагаю продолжить разговор о микроклональном размножении растений. Тема эта сложная, многогранная, но я надеюсь, что постепенно мы вместе придём к пониманию всей технологической цепочки клонирования растений.
Предыдущие статьи из этого цикла вы можете почитать здесь, а сегодня предлагаю поговорить о том, как в технологии микроклонального размножения происходит оздоровление посадочного материала от патогенов. Среди основных патогенов растений можно выделить грибы, бактерии и вирусы. Есть ещё, конечно, и насекомые, которые могут нанести растению существенный вред, например клещи, нематоды, тля, различные гусеницы и личинки. Но в разрезе микроклонального размножения, насекомые, даже очень маленькие, не так страшны, как вирусы, бактерии и грибы. Дело в том, что технология первичной обработки растений перед микроклональным размножением не оставляет насекомым никаких шансов выжить.
В ходе подготовки тканей растения для клонирования происходит несколько этапов очистки от патогенов. Всё начинается с того, что для микроклонального размножения отбирают внешне здоровые растения, без признаков заболеваний, по возможности чистые и молодые части, не поражённые вредителями, например молодые верхушечные побеги.
Вторым этапом происходит внешняя очистка отобранных экземпляров. На поверхности растения может быть пыль, споры дрожжевых грибов, личинки или яйца насекомых и другие загрязнения. Для начала отобранные ткани промываются в дистиллированной воде, затем в растворе этанола, и далее в растворе хлора. Между этанолом и хлором промывку в дистиллированной воде повторяют, и в ней же осуществляют финальную промывку. Время экспозиции в каждом растворе составляет не более 10 минут. Что бы процесс проходил более эффективно, рекомендуется использовать магнитную мешалку. После такой процедуры мы получаем чистое снаружи растение. Часто, но далеко не всегда, такой очистки бывает достаточно, и подготовленные таким образом ткани отправляются дальше по технологической цепочке для размножения.
Очень часто внешней очистки растения бывает недостаточно. Как я писал в прошлых материалах, у биотехнолога не всегда есть возможность отбора качественных растений для размножения. Бывает такое, что в лабораторию обращаются клиенты, имеющие в своём распоряжении единственный экземпляр растения, которое нужно размножить. Это растение может быть сильно поражено патогенами. И тут уже приходится работать с тем, что есть. Степень «чистоты» растения во многом зависит от условий произрастания и качества ухода за ним. Но реальность на сегодня такова, что большинство растений, попадающих в лаборатории микроклонального размножения, заражены внутренними патогенами. И если при обычном росте иммунитет растения спокойно справляется с незваными гостями, то в процессе микроклонального размножения, эти гости могут уничтожить все результаты труда биотехнолога. Давайте разбираться подробнее.
Этап 1. Осмотр, внешняя очистка и оздоровление растения
Любые вновь поступившие растения сразу отправляются на индивидуальный карантин. Как только в лабораторию микроклонального размножения попадает растение, биотехнологу первым делом стоит провести его внешний осмотр. В ходе осмотра необходимо очень внимательно исследовать растение и постараться выявить все признаки поражения. Растение может плохо себя чувствовать из-за болезней или из-за неправильного ухода, например, из-за дефицита или избытка питательных веществ, перелива или недостаточности освещения. Все части растения очень внимательно осматриваются на предмет насекомых, продуктов их жизнедеятельности, а также дефицитов — например засохших или изменивших цвет листьев, искривлений ствола, ветвей и листвы, и т.д.
Следующим этапом осматривается поверхность грунта, в котором растёт растение. Грунт постепенно разгребается, осматриваются его внутренние слои. Затем растение извлекается из грунта и производится осмотр корневой системы.
Если были выявлены заражения или негативные факторы и если времени на размножение достаточно, то растение может отправиться на оздоровление. Тут могут быть проведены следующие процедуры:
- Очистка от насекомых. В случае обнаружения на самом растении или в грунте насекомых — производится обработка от них. Причём не важно, полезные это насекомые или нет, избавиться необходимо от всех. Сначала насекомые удаляются механически, затем всё растение и грунт обрабатывают инсектицидами.
- Полная замена грунта. Часто растения поступают с сильно истощённым грунтом. Питательных веществ в грунте недостаточно, и растение начинает страдать. В таких случаях замена грунта приводит к хорошему оздоровлению растения за две–четыре недели. Растения хорошо отзываются на эту процедуру и довольно быстро начинают давать как новые побеги, так и увеличивать корневую систему. Также грунт необходимо менять, если обнаружите грибной мицелий или почвенных насекомых.
- Подрезка верхней части растения и корневой системы. Если растение, поступившее в лабораторию, имеет отмершие части, то они удаляются. Также для оздоровления часто применяют подрезку корневой системы, с обязательным удалением отмерших корней. В зависимости от вида растения удаление центральной точки роста может приводить к боковому ветвлению, что, в свою очередь, приводит к увеличению получаемого материала для микроклонального размножения.
- Противогрибковая, противобактериальная, противовирусная обработка. Часто поражения грибами и бактериями имеют визуальные проявления — например неестественные пятна или наросты на растении, угнетённое состояние. В случае выявления таких поражений растение обрабатывается специальными средствами от болезней.
- Черенкование растения. Иногда при сильном поражении растения патогенами или болезнями применяется черенкование. Для этого срезается молодой побег растения, обрабатывается стимулятором корнеобразования и помещается либо в воду, либо в питательный субстрат. Далее материал для микроклонального размножения мы получаем уже с нового, укоренённого растения.
Выше я перечислил основные способы оздоровления растений. Напомню, что подходят они только в том случае, если у вас на размножение есть достаточное количество времени. Например, заказ вы получили осенью, а клонированные растения от вас ждут к весне, к началу сезона. В этом случае оздоровить растения будет очень желательно. Рассмотрим основные этапы подробнее.
Этап 2. Избавляемся от бактерий
Думаю, многим известно, что снаружи и внутри тела человека живут триллионы бактерий. Все живые существа представляют собой некий симбиоз из разных организмов, и растения тут не исключение.
Бактерии — одна из самых первых форм жизни на нашей планете. Их разнообразие просто огромно, и их вклад в общий процесс жизни нельзя недооценить. Бактерии могут жить как снаружи, так и внутри растения. Бактерии могут помогать, а могут и вредить нашим зелёным друзьям. В качестве полезных бактерий можно привести в качестве примера азотфиксирующие бактерии, создающие симбиоз с растениями.
Если вам доведётся убирать засохшие стебли бобов — вырвите один с корнем, слегка стряхните землю и посмотрите на корневую систему. Вы легко обнаружите на поверхности корней небольшие клубеньковые наросты, часто они бывают светло-коричневого, красноватого цвета. Эти клубеньки как раз и есть результат жизнедеятельности бактерий азотфиксаторов. Эти бактерии связывают азот из окружающей среды (почвы, воздуха) и отдают его растению, а растение предоставляет бактериям дом на своих корнях и другие питательные вещества. Такие наросты можно обнаружить практически на всех бобовых растениях, будь то однолетние травы, кустарники или деревья. Вот такой взаимовыгодный обмен.
Но не все бактерии полезны. В случае ослабления иммунитета растения у него может развиться бактериальное заболевание — бактериоз. Все бактериозы довольно опасны, так как очень часто без применения специальных мер могут привести к полной гибели растения. Некоторые бактерии поражают только один вид растений, другие довольно универсальны и поражают разные растения. Поэтому в лаборатории микроклонального размножения очень важно иметь отдельное карантинное помещение, где вновь прибывшие растения будут изолироваться как от других растений, так и от основного блока лаборатории.
Для борьбы с бактериальной инфекцией используют две основные процедуры:
- Обработка противомикробными средствами. Как правило, от бактериальных поражений применяют антибиотики узкого или широкого спектра действия. При бактериальных поражениях заражёнными часто оказываются все части растения. Обработку проводят непосредственно самого растения, грунта (его по возможности необходимо полностью заменить) и тары в которой растение живёт. Если растение приехало в лабораторию в пористом керамическом горшке, то такой горшок лучше заменить на гладкий пластиковый.
- Создание специальных условий. Очень часто растения подвергаются бактериозу тогда, когда оказываются в неблагоприятных условиях. Такими условиями могут быть низкая или высокая температура, чрезмерная влажность грунта, блокировка питания, отсутствие вентиляции и т.д. Если условия для растения оптимальны, то его иммунная система способна противостоять бактериям. В случае бактериального заражения помимо антибиотиков очень важно создать неблагоприятные для бактерий условия — изменить влажность, температуру, и благоприятные для самого растения — достаточная освещённость, хорошая вентиляция.
Этап 3. Избавляемся от грибов
У кого-то при слове грибы в воображении появляются образы белых грибов, опят, лисичек, шампиньонов и вешенок. Но на самом деле царство грибов просто невероятно огромно, и не все грибы формируют привычные нам плодовые тела. 99% грибного мицелия находится под покровом грунта. Думаю, многие слышали про микоризу — полезный симбиоз между растениями и грибами. Гифы грибов прорастают непосредственно внутрь тканей растения, внутрь корневой системы, и образуется очень прочная взаимозависимая связь. Растение питает грибницу водой и глюкозой, а грибница питает растение минеральными веществами, которые растение само добыть не в состоянии. Есть подтверждённые исследования о том, что через гифы грибницы деревья могут обмениваться питательными веществами с другими деревьями. Иногда такую систему называют природным интернетом — сеть, в которой всё связано со всем. И это пример положительного симбиоза между грибами и растениями.
Но и тут есть исключения — грибы-патогены. Заболевания, вызванные грибами, часто называют микозами, и к ним можно отнести пероноспорозы, мучнистые росы, ржавчины, гнили, некрозы, трехеомикозы и т.д. Для борьбы с грибными патогенами используют ту же стратегию, что и при борьбе с бактериозами, — создание негативных условий для грибов и химическая обработка. Для противогрибной обработки используют фунгициды узкого или широкого спектра действия.
Как правило, ни бактерии, ни грибы не проникают внутрь клетки растения, обитают они либо на поверхности растения, либо в межклеточном пространстве. Это значительно упрощает борьбу с ними. Часто для избавления от этих патогенов требуется несколько циклов обработки и пересадки растений, и эти требования более чем оправданны.
Зачем избавляться от грибов и бактерий?
Обычно перед микроклональным размножением любой материал проходит первичную обработку от бактерий и грибов. Казалось бы, зачем это делать, если растение выглядит внешне здоровым? Дело в том, что питательный субстрат, на котором проводится клонирование растений, является благоприятной средой и для многих других микроорганизмов. Глюкоза и микроэлементы питательной среды Мурасиге — Скуга делают её идеальной для разрастания мицелия и бактерий. И если на питательную среду попадёт хоть одна спора грибов, то довольно быстро мицелий колонизирует весь субстрат, и сделает это он в считанные дни, не оставив никаких шансов клонам растения.
Если внутри контейнеров с эксплантами появился белый пушок, волоски, образования неестественного цвета и формы — всё это говорит о заражении, и такие контейнеры подлежат утилизации, а все подготовительные процедуры становятся прямыми убытками, так как спасти заражённые контейнеры возможности нет. Поэтому так важно тщательно отбирать размножаемые растения и следить за стерильностью на всех этапах микроклонального размножения.
Этап 4. Избавляемся от вирусов
Вирусы в царстве живой природы стоят особняком. И при микроклональном размножении тоже требуют особого подхода. Дело в том, что в отличие от бактерий и грибов вирусы могут проникать сквозь клеточную стенку внутрь клетки растения, и это очень сильно усложняет борьбу с ними. Многие вирусные заболевания не лечатся, и в случае обнаружения вирусного заражения посадки могут уничтожаться целиком.
Но у растений есть одно замечательное качество, способствующее борьбе с вирусами при микроклональном размножении. Предположение о таком свойстве растений было сделано в 30-е годы ХХ века, а его подтверждение произошло в 50-х годах того же века. Дело в том, что меристемная часть растений, как правило, не поражается вирусами. И если правильно извлечь и подготовить эту ткань, то мы получим безвирусный посадочный материал.
При микроклональном размножении очень важно, какой материал мы используем для клонирования. Части листочков и стеблей растения лучше поддаются клонированию, а молодая меристемная ткань — хуже. Но в частях листочков и стеблей вероятность присутствия вирусов уже намного больше. Так что тут микробиологу придётся искать золотую середину.
Часто для избавления от вирусов делают несколько этапов наращивания меристемы. Выглядит это следующим образом. С растения берётся меристемная ткань, которая, по мнению специалиста, в наименьшей степени подвержена вирусному заражению. Эта ткань помещается на питательную среду, способствующую росту этой же меристемной ткани. После того как ткань увеличилась в размерах, уже с неё берётся небольшая часть самых молодых клеток, и весь цикл повторяется. Так за несколько переносов можно полностью избавиться от вирусов. Но такой процесс довольно долгий и трудоёмкий, и ещё в таком варианте бывает довольно сложно подбирать состав питательной среды для того, чтобы из меристемной ткани сформировать остальные ткани растения — стебли, листья и корни.
Противовирусная термотерапия
Одним из эффективных способов борьбы с вирусами в тканях растений является термотерапия. Многие вирусы очень чувствительны к температуре окружающей среды, и, если температура становится некомфортной, вирусы или уходят в режим покоя, или погибают. Обычно для борьбы с вирусами используют повышенную температуру. Для этого растение вместе с субстратом помещают в специальные термокамеры с регулировкой температуры. В этих камерах, постепенно, не больше чем на 2 градуса в сутки, поднимают температуру до 37 градусов по Цельсию. При этом очень важно поддерживать в норме остальные условия — влажность грунта и воздуха, освещённость, вентиляцию.
Метод этот один из самых действенных, считается, что при повышенной температуре разрушается белковая оболочка вируса и нуклеиновые кислоты внутри. Также при такой температуре процессы, проходящие внутри растения, начинают угнетающе влиять на способность вируса к размножению. Выдерживают растения в такой «лечебной бане» довольно долго, сроки начинаются от 10 недель. На выходе мы получаем практически чистое, безвирусное растение, которое можно клонировать с наименьшей вероятностью заражения.
Противовирусная химиотерапия
Ещё одним способом борьбы с вирусами является применение противовирусных препаратов. Самым известным, пожалуй, является препарат с названием «Виразол». Препарат этот довольно дорогой. Его особенностью является то, что он очень эффективен в разрушении кусочков РНК и ДНК вирусов, имеет очень широкий спектр действия в отношении разных вирусов. Противовирусные препараты добавляются в питательную среду, и на ней уже проводятся все этапы микроклонального размножения. Наибольшую эффективность в борьбе с вирусами даёт совмещение термо- и химиотерапии.
Давайте подытожим:
- Для микроклонального размножения нужно стараться подбирать здоровые, крепкие растения.
- Если растение заражено и требует дополнительной обработки, учитывайте это при выставлении финальной цены размножения. Избавление от патогенов требует затрат времени, сил и ресурсов, всё это стоит денег. И часто в смете на услуги лаборатории очистка растения идёт отдельной строчкой со своей стоимостью.
- Соблюдайте стерильность на всех стадиях производства, отслеживайте возможные заражения. Материнские растения старайтесь изолировать друг от друга и от вновь поступающих.
- Не пренебрегайте технологией размножения. Небольшие оплошности могут привести к серьёзным потерям.
Ну а самое главное — не опускайте руки. Обычно заражение патогенами происходит на этапе запуска лаборатории и обкатке производственных процессов. С опытом все заражения могут быть сведены к нулю. Хороших всем урожаев!