растения в контейнере
Фото: shutterstock.com

Микроклональное размножение. Факторы успеха

Последнее обновление:
Слушать статью

Здравствуйте! На связи Сергей, и я предлагаю продолжить разговор о микроклональном размножении растений.

При клонировании растений для получения прибыли очень важно обеспечить большие объёмы производства клонов. Растения из лаборатории продаются относительно дёшево, их стоимость в 3–10 раз ниже, чем стоимость подращённых растений из питомника. Производить 10 или 100 растений методом микроклонального размножения совсем невыгодно. Я уже писал о том, что себестоимость при микроклональном размножении снижается пропорционально количеству производимых растений. И прибыль растёт соответственно. Из этой простой формулы можно сделать вывод: производить клоны стоит в максимально большом количестве (тут, конечно, следует учитывать возможности реализации продукции). Но чем больше партия растений, тем выше цена ошибки. Неправильно подобранная питательная среда, неправильное фитооблучение, слишком низкая или слишком высокая температура, контаминация вследствие несоблюдения стерильности могут привести к большим потерям. Давайте рассмотрим критические моменты для технологии микроклонального размножения.

растения в пробирках
Фото: aquariumtorg.ru

Выбор материнского растения

Про это я уже немного рассказывал в предыдущих материалах. Итак, при выборе материнского растения следует учитывать:

Коммерческий потенциал

Да, именно этот фактор я поставил на первое место. Как гласит поговорка: деньги очень легко превратить в товарные запасы, а вот товарные запасы превратить в деньги намного сложнее. Как бы ни было сложно микроклональное размножение конкретного растения — это всё же решаемый технический вопрос. Важно понимать, кому клоны можно будет продать, да ещё и в больших объёмах, и в короткий срок. Я бы рекомендовал искать потенциальных кандидатов на микроклональное размножение даже перед тем, как составлять бизнес-план лаборатории микроклонального размножения. Также следует учитывать, что на сегодня не все растения размножаются микроклональным способом. Это не говорит о том, что определённые растения невозможно клонировать. Скорее тут следует сказать, что если вы выберете растение, которое до вас никто не размножал микроклонально, то вам придётся потратить много времени, сил и ресурсов на получение клонов от него. В этом случае технологию размножения придётся создавать с нуля, а это долго и дорого.

Здоровье материнского растения

Очень важно подбирать качественные растения для микроклонального размножения. Идеально — растения, выращенные в закрытом грунте под наблюдением. Ещё лучше — в стерильных условиях. Это позволит свести к минимуму риски бактериального, вирусного и грибного заражения.

Свойства материнского растения

Поскольку все клоны, полученные в лаборатории, генетически идентичны материнскому растению, к свойствам этого растения нужно проявить максимальное внимание. В правильном варианте — провести начальный отбор материнских растений. Критериями отбора будут служить урожайность, скорость вегетации, качество получаемой продукции, устойчивость к заболеваниям и неблагоприятным условиям. Например, вы решили размножать малину. Стоит подыскать «идеального кандидата». Это может быть высокоурожайный гибрид, выбранный из таких же гибридов, но в чём-то превосходящий их. В отношении малины это может быть количество, размер и вкус ягод, урожайность, скорость зацветания и т.д. Часто бывает так, что среди растений, выращенных из семян, появляются «чемпионы», именно их и стоит разыскивать для размножения.

растения в контейнерах
Фото: biotech-educenter.skoltech.ru

Состояние роста

Для микроклонального размножения стараются использовать молодые, растущие ткани растения. Например, клетки в осеннем, но ещё зелёном и здоровом листе сложнее заставить делиться, чем клетки молодого побега. Иногда материнское растение необходимо подготовить к размножению. Для этого проводят имитацию сезонности — например, устраивают растению режим покоя, постепенно снижая температуру, а потом — повышая её, регулируют уровень и продолжительность освещённости. Для растения такие изменения выглядят как зима. А последующее повышение температуры и увеличение продолжительности светового дня воспринимается как весна и команда на бурный рост. Для всех растений будет справедливо сказать, что молодые, активно растущие растения легче размножаются микроклональным способом, чем взрослые экземпляры в состоянии покоя или замедления роста.

Выбор материала для клонирования

После того как вы определились с конкретным растением для клонирования, стоит изучить опыт его размножения. Для этого нужно отправиться на специализированные биологические ресурсы. Тут будет полезно знание английского языка. В России тоже проводились эксперименты и описаны технологии микроклонального размножения разных культур. Но западные и китайские учёные сделали в этой области огромный прорыв. Материалов в сети на английском языке на порядок больше, чем на русском. Также следует сказать, что в нашей стране нет организаций, которые бы занимались переводом подобных научных работ.

На сегодня описаны технологии клонального микроразмножения более чем 200 видов растений. В описаниях можно найти подробные инструкции по составу питательных сред, созданию оптимальных условий вегетации. Также в этих описаниях можно найти предпочтительные ткани для размножения растений. Обычно для этих целей могут использовать окончания стеблей, молодые листочки, зародыши, чешуйки луковиц, пазушные почки, части соцветий — всё, что содержит меристемные клетки.

Например, ещё в далёком 1975 году, учёными микробиологами Филипсом и Грином в опытах с кукурузой было установлено, что эмбрионы, извлечённые из спелых семян кукурузы, могут образовывать только корни и каллусную ткань. А если использовать невызревшие семена и изолировать зародыши через пару недель после опыления, то из такого материала можно получать полноценные растения. Согласитесь, знание такой информации существенно упрощает и ускоряет процесс клонирования.

суккуленты
Фото: pxhere.com

Ещё один пример — растение Echeveria. Это растение относится к популярным сейчас суккулентам из семейства толстянковых. Второе название — каменная роза. Суккуленты в силу своей неприхотливости и необычного вида сейчас очень популярны в комнатном растениеводстве. Эти растения часто используют как в одиночных посадках, так и во флорариумах. И конечно, их не обошли стороной и микробиологи. Растут суккуленты медленно, размножаются сложно. Поскольку эхиверия представляет собой розетку утолщённых листьев, именно листья и использовали в качестве материала для микроклонального размножения. Микробиологами было установлено — если использовать старые листья, располагающиеся по краю розетки, то у них образуются только побеги, из молодых, в центре растения — только корни. А вот если использовать для клонирования листья средние по возрасту из центральной части растения, то легко образуются и побеги, и корни.

Размер экспланта для клонирования

В теории для микроклонального размножения достаточно пары клеток материнского растения. Такие эксперименты проводились, и проводились успешно. В реальности для микроклонального размножения используют не две и не 20 клеток, а намного больше. Чем больше размер экспланта, тем выше шансы на успешное размножение. Но чем больше эксплант, тем выше вероятность того, что в нём будут содержаться вирусы, бактерии и грибы. Тут следует искать золотую середину. Важно, откуда поступило материнское растение и в каком оно состоянии. Иногда материнские растения требуют специальной подготовки. Подробнее про это можно почитать здесь.

Тут нужно руководствоваться принципом рациональности. Если вам известно, что растение чистое, ничем не заражено, то можно для клонирования использовать кусочки растения побольше, это существенно увеличит выход и скорость роста новых клонов. Если есть информация, что растение заражено, для размножения используют экспланты поменьше. Это повышает шансы на получение здоровых клонов.

Длительность культивирования

Пассаж — это одна операция по подготовке и помещению на питательную среду эксплантов. Обычно материнское растение используют только для первого пассажа. Следующие пассажи делают с предыдущих. Состояние и свойства эксплантов меняются от пассажа к пассажу. При большом количестве пассажей способность образования корней у клонов растёт. Объясняется это общим омоложением клеток, что существенно повышает жизнеспособность и скорость роста клонов. Но при размножении некоторых растений, спустя 20–50 пассажей, жизнестойкость клонов и способность эксплантов образовывать корни, побеги и листья сильно падает. Очень важно следить за жизнестойкостью эксплантов после каждого пассажа.

клоны растений
Фото: api.rbsmi.ru

Если микробиолог замечает снижение продуктивности новых эксплантов, то материал для клонирования обновляют, используя снова материнское растение или более ранние пассажи. Некоторые лаборатории микроклонального размножения создают свой фонд эксплантов. Обычно это клоны, полученные на ранних пассажах. В отношении них должны быть достоверно установлены отсутствие патогенов и способность к активному размножению. Хранят такие экспланты в особых условиях при сниженной температуре. Сам фонд тоже обновляется с определённой периодичностью. На создание таких фондов лаборатории тратят годы, зато это позволяет очень быстро получить большое количество клонов из уже введённых в культуру растений.

Стерильность

«Стерильность, стерильность и ещё раз стерильность!» Эта фраза вполне может быть лозунгом любой лаборатории микроклонального размножения. На начальных этапах запуска лаборатории, заражение питательной среды является главной причиной неудач и потерь. Если на питательной среде начали развиваться бактерии или грибы, остановить этот процесс уже невозможно. Может, возможно, но точно нецелесообразно. Внешнее заражение — это процесс, при котором патогены попадают в контейнеры с эксплантами извне. Причиной такого заражения может быть нарушение технологии автоклавирования и работы в ламинаре. Но бывает и внутреннее заражение — когда патогены находятся не в питательной среде, а в самом растении. Такое заражение представляется более опасным. Стоит сказать, что учёные сейчас активно работают над поиском технологий, снижающих риск заражения контейнеров с клонами растений, и способов по оздоровлению уже заражённых эксплантов.

Агрегатное состояние питательной среды

При вводе в культуру нового растения можно экспериментировать с физическим состоянием питательной среды. Питательные среды могут быть твёрдыми, жидкими и комбинированными. Чтобы сделать питательную среду густой, используют агар-агар. Агар-агар — это желирующее вещество, получаемое из морских водорослей. Добавляется порошок агара в разогретую питательную среду. Далее при остывании среда густеет и становится плотной, похожей на желе. Чем больше добавлено агара, тем более твёрдой получается питательная среда.

Некоторые растения лучше размножаются на жидких средах, другие — на твёрдых. В жидких средах питательные элементы более подвижны и обеспечивают лучшее питание растений. Но жидкие среды подходят не для всех растений. Твёрдые среды дают растениям лучшую опору, но питательные вещества в них могут быть распределены неравномерно. Учитывая малый размер эксплантов, это может стать критичным. Например, локально, в месте помещения экспланта на питательную среду, может оказаться дефицит тех или иных веществ. Это напрямую отразится на росте и состоянии клона. Иногда используют комбинированные среды. Например, при размножении сортовых роз, нижний слой делают твёрдым агаризированным, а верхний жидким. На такой среде экспланты роз развиваются намного быстрее.

Состав питательной среды

Выше я писал, что на сегодня микроклональным способом размножают больше 200 растений. Это значит, что для всех этих растений существуют подробные описания технологии с точным составом питательных сред. Любая питательная среда содержит фитогормоны, углеводы (как правило, глюкозу), набор минеральных элементов и витамины. Наиболее распространены следующие питательные среды:

  • Мурасиге — Скуга,
  • Хеллера,
  • Линсмайера — Скуга,
  • Нича,
  • Шенка — Хильдебрандта,
  • Гамборга.
растения в чашке Петри
Фото: cals.ncsu.edu

У всех на слуху среда Мурасиге — Скуга, именно этим учёным удалось первыми получить хороший повторяемый результат при микроклональном размножении. Да и сейчас эта среда используется для размножения очень большой части растений. Но эту среду не используют в неизменном виде. Для разных растений в ней меняют концентрации входящих в состав веществ. Также от состава среды зависит рост определённых тканей. Например, для одного и того же растения среда будет разной для выращивания калусной ткани и для стимулирования корнеобразования, например. Иногда в среде могут быть критичны даже десятые доли процента, например гормонов или минеральных солей.

Подбор подходящей питательной среды для культивации конкретного растения является, пожалуй, одной из самых больших статей расходов (за исключением непосредственной закупки оборудования лаборатории). Эта процедура очень похожа на научную исследовательскую работу. Микробиолог последовательно меняет количество компонентов в питательной среде, и проверяет эффективность роста на ней. Например, существует рецепт питательной среды для размножения берёзы повислой. Этот рецепт разрабатывали для какого-то конкретного дерева, растущего в конкретном месте. Берёза из другого региона планеты может относиться тоже к повислым берёзам, но иметь другую генетику и чуть отличные обменные процессы. Для такого дерева начальная питательная среда может не подойти, нужно будет менять концентрацию гормонов или минеральных веществ. Ну и эта среда, скорее всего, не будет работать для карельской берёзы (хотя она относится к разновидности повислых берёз), берёзы далекарлийской, чёрной или маньчжурской берёз.

Для каждого из этих деревьев потребуется корректировка состава среды. И тут фактором успеха будет доступ к качественным компонентам среды. Например, качество агар-агара очень сильно влияет на успех микроклонального размножения. Агар можно купить и в маркетплейсе, и в продуктовом супермаркете, но будет он низкого качества с большим количеством примесей, вырастить на таком ничего не получится. Это же справедливо и для гормонов. Агар, купленный в садовом центре, тоже не годится. Для микроклонального размножения стараются использовать специальные чистые компоненты среды.

Квалификация и опыт персонала

Исходя из того что микробиологу в лаборатории клонирования растений приходится заниматься и исследовательской работой, фактором успеха будет квалификация персонала. Думаю, на рынке рабочей силы в России нет свободных опытных специалистов по микроклональному размножению. Поиск такого человека может превратиться в квест. В нескольких вузах нашей страны проводятся платные обучающие курсы по микроклональному размножению. На такой курс может поступить любой желающий, независимо от уровня образования.

Если вы далеки от химии и биологии, учёба будет непростой. На таких курсах исходят из того, что слушатели обладают начальными знаниями в области микробиологии. Если таковых знаний нет, придётся потратить время на самостоятельное изучение ряда вопросов. Как вариант, можно нанять начинающего специалиста и отправить его на такие курсы. Кроме этого, биологи довольно общительный и открытый народ, опытных специалистов можно найти на тематических форумах и попросить у них платную консультацию. По моему мнению, экономить на ключевом персонале не стоит, в итоге такая экономия выйдет себе дороже. Напротив, стоит вкладываться в развитие персонала, отправляя людей на обучение и поощряя инициативы.

Физические факторы выращивания

Таких факторов довольно много, попробую перечислить основные:

Тара для выращивания

Это очень важный пункт. Желательно, чтобы тара могла выдерживать высокие температуры и давление, а также была герметичной. Для микроклонального размножения используют стеклянные ёмкости. Но сейчас всё больше лабораторий переходят на пластиковые контейнеры. Контейнеры нужно подбирать соответствующие определённым характеристикам. В отличие от стеклянной тары, которую можно мыть и стерилизовать, контейнеры одноразовые. Что дешевле — мыть стекло или каждый раз покупать новые контейнеры, нужно считать в каждом конкретном случае. Но безусловным фактом является большое удобство использования пластика. Второй фактор успеха — герметичность.

растения в лаборатории
Фото: meristematic.com

Стерилизация питательной среды обычно проводится уже непосредственно в таре. Контейнеры помещают в автоклав, и там они находятся до 12 часов (в зависимости от разных факторов) при температуре 120 градусов по Цельсию и давлении до 2 атмосфер. Чем выше температура и давление, тем короче может быть процесс стерилизации. Но стерилизовать меньше 40 минут не стоит. Соответственно, тара должна выдерживать такие условия, не должна плавиться, терять форму, крышки не должны самопроизвольно открываться.

Соотношение объёма питательной среды и количества растений в одной единице тары

При больших объёмах производства увеличение объёма питательной среды в каждом контейнере на 50 мл может привести к серьёзному увеличению расходов на эту среду. При микроклональном размножении очень важно подбирать оптимальный объём питательной среды. Если говорить про клонирование в пластиковых контейнерах, то обычно их наполняют питательной средой минимум на 1 см. Для размножения, как правило, используют небольшие контейнеры объёмом от 250 мл до 1 л. Контейнеры используют невысокие, с широким дном и ровными стенками. Конусные и круглые контейнеры в силу низкой эргономичности использовать не стоит. На эффективность размножения могут также влиять расположение экспланта (горизонтальное или вертикальное), тип пробок (ватные, пластмассовые, стеклянные, металлические и т.д.), а также соотношение объёма эксплантов и количества питательной среды для оптимального освещения и газообмена эксплантов. Важно, чтобы в контейнере была достаточная воздушная прослойка и высота до крышки, для запаса на рост эксплантов.

Количество растений в контейнере

От этого фактора тоже напрямую зависит успех клонирования растений. В пластиковый контейнер размером 10 на 10 см можно уместить и 100 растений, согласитесь, количество впечатляет. Но обычно такие густые высадки не делают. Каждому растению необходимо достаточное пространство для роста, и на одно растение отводят от 3 кв. см площади контейнера. Важно не загущать посадки и для нормального освещения растений. Часто контейнеры с эксплантами выставляют на стеллажах друг на друга. Таких «этажей» может быть и два, и три, максимально до пяти. При таком размещении контейнеров нижним достаётся меньше света, а если посадки будут загущены, то света нижним контейнерам будет совсем не достаточно, и растения в них не будут развиваться. Раз в несколько дней «этажи» из контейнеров меняют местами, поднимая нижние наверх. Это позволяет получать здоровые растения и экономить на площади стеллажей и электричества.

Температура культивации

У каждого растения есть свои оптимальные условия роста. Обычно при понижении температуры более активно развивается корневая система, а при повышении — надземная часть. При сильном изменении температуры рост эксплантов прекращается, при критическом они могут погибнуть. Важно знать температурные коридоры для каждого из растений. Например, у баклажанов при снижении температуры ниже 16 градусов Цельсия рост полностью прекращается. Если температура будет такой или ниже, экспланты баклажанов просто замрут и не будут развиваться. Для некоторых растений суточные изменения температуры, наоборот, могут стимулировать развитие корней или надземной части, знание таких особенностей позволит оптимизировать процесс выращивания клонов. Обычно на этапе культивации температуру поддерживают в коридоре 20–26 градусов Цельсия днём и 18–22 градуса ночью.

Фитооблучение

Не пугайтесь этого термина, если говорить просто — это освещение растений. Термином пользуются профессиональные биологи, и он полностью отражает специфику взаимодействия растения и света, ведь у растений нет глаз, поток света для них выглядит как бомбардировка фотонами. Любой поток света имеет определённый спектр. В спектре может быть много красного или синего света. Растения на это реагируют по-разному. Приведу пример по теме. Карельские берёзы относятся к листопадным деревьям, и, как правило, осенью, даже в условиях закрытого грунта, сбрасывают листья и уходят в период покоя. Чтобы в условиях лаборатории не позволить дереву уйти в период покоя, его облучают синим спектром света. Это позволяет продлить срок вегетации на два-три месяца. Соответственно, на этот период увеличивается окно для работы с материнским растением. Также при изменении спектра можно добиваться или роста корней, или роста надземной части. Разные спектры действуют на конкретное растение по-разному. Например, красный спектр у табака вызывает рост почек, у салатов стимулирует рост побегов, а у берёз — развитие корневой системы. На начальных этапах эксплантам требуется освещённость интенсивностью 1000–3000 люкс. Фотопериод должен длиться 14–16 часов. Высокая интенсивность фитооблучения может вызывать хлорозы и задержки развития, при недостатке освещённости растения могут погибнуть. И ещё нужно учитывать, что влияние спектра света на растение сильно зависит от концентрации гормонов в питательной среде.

Я перечислил только основные факторы успеха микроклонального размножения. Как можно понять — процесс этот не самый простой, но при должном усердии вполне осуществимый. Пробуйте, если не получается — пробуйте снова, и успех вам гарантирован. Всем больших урожаев!

Поделись
0 0 голоса
Рейтинг статьи
Подписаться
Уведомить о
guest
0 комментариев
Межтекстовые Отзывы
Посмотреть все комментарии