растения
Фото: ООО НПП Микроклон

Микроклональное размножение. Этапы технологии

Последнее обновление:
Слушать статью

Продолжаем тему микроклонального размножения. Мы уже обсуждали основы процесса, говорили об оборудовании лаборатории и о тех важных вещах, которые нужно продумать до составления бизнес-плана.

Предыдущие материалы цикла можно посмотреть тут, а сегодня мы остановимся более подробно на этапах микроклонального размножения растений. Тема эта будет уже чуть сложнее предыдущих материалов. Напомню, при написании статей по микроклональному размножению я ориентируюсь на новичков в этой теме. Цель данных материалов — показать подробно процесс микроклонального размножения будущим биотехнологам или создателям лабораторий, чтобы вы могли оценить свои силы, ресурсы и возможности перед входом в эту нишу рынка. Ну а для опытных биотехнологов скажу, что я не отношу себя к абсолютным экспертам в этой области и буду благодарен за ваши комментарии и уточнения. Итак, приступим.

Недавно мы писали о запрете ввоза в нашу страну посадочного материала из недружественных стран, в частности о том, что в ближайшее время может возникнуть дефицит рассады многих растений, например садовой земляники. Кроме садовой земляники в нашу страну завозили много других саженцев плодовых и декоративных культур. Например, большая часть хвойных, продаваемых на территории РФ, завозилась из Польши, теперь этот канал поставок закрыт.

Если вы планируете развивать бизнес в аграрном секторе, то лучшего времени для входа на рынок не найти. Создание лаборатории микроклонального размножения позволит принять участие в импортозамещении и найти клиентов среди крупных садовых питомников. Напомню, что в зависимости от специализации лаборатории микроклонального размножения открыть её можно в условиях города на относительно небольшой площади. На начальном этапе подойдёт даже комната в квартире, если, конечно, люди, проживающие с вами, будут не против.

Этап 1. Выбор растения-донора

При выборе растения для размножения нужно учесть несколько моментов.

Во-первых, размножаемое растение должно быть востребованным у конечных покупателей — нужно понимать, как, кому и по какой цене вы будете продавать клоны.

Во-вторых, размножение выбранного растения должно быть довольно сложным семенным или вегетативным способом. Например, можно выбрать гибриды растений — как мы знаем, у семян, полученных от гибридов, родительские признаки, как правило, не наследуются. Семена гибридов довольно дороги. Мне попадались гибридные листовые и кочанные салаты израильской селекции по цене 180 руб. за упаковку, содержащую три семени. Конечно, рассаду салата, полученную микроклональным способом, продать будет сложно (но не невозможно, рынок на подобную продукцию просто не сформирован), но вот клоны гибридных помидоров, перцев или бахчевых в сезон могут разойтись очень хорошо. Хорошими кандидатами могут стать комнатные растения, плодовые и декоративные культуры.

В-третьих, материнское растение должно быть здоровым. Идеально, если вы вырастите материнское растение в чистой среде или получите такой образец у стороннего поставщика. В теории технология микроклонального размножения позволяет очистить любой материал от патогенов, паразитов и болезней, но это довольно сложный процесс, требующий дополнительных затрат сил и времени.

Этап 2. Подготовка растения-донора

В зависимости от происхождения растения-донора потребуется его определённая подготовка. Небольшие растения, выращиваемые в открытом грунте, выкапываются и переносятся в закрытый грунт на карантин. Если выкопать растение невозможно, то с него срезают побег и укореняют в закрытом грунте. Иногда это помогает избавиться от части патогенов и немного обновить материнское растение, но процесс укоренения и финального размножения в этом случае довольно долгий. Если времени мало или растения не размножаются вегетативно (например, берёзы, орехоплодные и т.д.), то работают непосредственно со срезанными частями растения. Большинство взрослых растений заражены патогенами, причём не важно, росли они на улице или в помещении. Очистку материала от патогенов я рассмотрю в отдельной статье, так как этот процесс довольно специфичный.

Этап 3. Изоляция эксплантов

В микроклональном размножении эксплантом называют группу клеток, используемую для размножения растений. Про методы микроклонального размножения разными частями растения я тоже расскажу в отдельном материале. Тут скажу лишь то, что экспланты можно получать из гипокотиля (это стебелёк растения между субстратом и семядольными листьями), пыльников стеблей, верхушечных частей растения, корней, семядолей.

При изоляции эксплантов очень важна стерильность, все работы проводятся в потоке ламинарного воздуха, инструменты стерилизуются, обрабатываются спиртом и раствором хлора, биотехнолог всегда работает в перчатках, которые тоже дезинфицируются после каждой операции.

Питательная среда для микроклонального размножения подходит не только растениям, на ней с радостью будут жить бактерии и грибы. Попадание даже одной споры приведёт к полной контаминации (заражению) всего контейнера с культурой клеток. Вылечить заражённую культуру очень сложно, и, если мы не ограничены в доступе к материнскому растению, делать это нецелесообразно. Обращу внимание на то, что заражение питательной среды приводит к значительным потерям, — мы готовили питательную среду, израсходовали химические вещества, потратили электроэнергию и время на автоклавирование, стерилизацию и работу ламинарного бокса, биотехнолог потратил своё рабочее время, всё это стоит денег. Кроме этого, при заражении культуры мы всегда теряем время, а фактор времени может быть очень важным. Например, если нам нужно вырастить рассаду к началу сезона, тут и две–четыре недели могут стать критичными.

Этап 4. Размножение стерильной культуры растения

После того как мы выделили экспланты, их необходимо размножить. На этом этапе речь не идёт о полноценном растении, мы просто размножаем выделенную культуру клеток. Происходит это благодаря свойствам питательной среды. Всё нужное для жизни клетки получают непосредственно из неё, а команду на размножение дают фитогормоны. Концентрация фитогормонов в среде влияет на поведение клеточной культуры. В зависимости от размножаемого растения и наших целей, мы можем растить либо клеточную культуру, либо небольшие клоны с боковыми побегами, но без корневой системы.

В качестве примера клеточной культуры можно привести каллусную ткань. Каллусные клетки могут образовываться у растения и в естественной среде, например, если ствол растения был повреждён, то место повреждения восстанавливается за счёт каллусных клеток. Но в условиях лаборатории микроклонального размножения растений биотехнолог, опять-таки за счёт манипуляций с составом питательной среды, может стимулировать образование у растения каллусных клеток. В этом случае речь идёт о дедифференцировании клеток. То есть из специализированных клеток растения, например верхушечных клеток, мы получаем неспециализированные клетки. Такие клетки ещё называют тотипотентными, из них за счёт изменения состава питательной среды можно получить любую ткань, свойственную для этого растения.

Тут можно провести аналогию со стволовыми клетками человека. Если о выращивании отдельных человеческих органов в пробирках мы только мечтаем, то в работе со многими растениями мы уже приближаемся к уровню творцов, согласитесь, это очень захватывающий процесс. Например, мне попадались исследования, в которых из неспециализированных клеток создавали ткань, идентичную ткани цветка растения. С практической точки зрения это не очень полезно, но как фундаментальный эксперимент — очень важно, и исследования в этой области продолжаются.

Этап 5. Размножение культуры клеток

После того как мы получили достаточное количество стерильных клеток, клеточная культура делится на меньшие части и снова помещается на питательную среду. По идее, каждая отдельная клетка может дать начало целому растению. На практике, конечно, никто не делит ткань на отдельные клетки. Опять в условиях стерильности биотехнолог открывает контейнеры с культурой, извлекает ткань растения и разрезает её на мелкие кусочки.

Далее следует очередной цикл наращивания клеточной массы. Если нам нужно много растений, процесс повторяется несколько раз. При этом количество получаемых «заготовок» будущих растений растёт в геометрической прогрессии. Например, в зависимости от вида растения в контейнере размером 10 кв. см можно уместить до 100 отдельных клеточных культур, каждая из которых в будущем станет самостоятельным растением, согласитесь, это очень здорово и продуктивно!

Контейнеры с клеточной культурой при правильной организации освещения можно размещать на стеллажах друг на друге в несколько слоёв, и одномоментно в лаборатории площадью 20 кв. м может находиться несколько десятков тысяч растений. В процессе деления клеточной культуры также возможно заражение питательной среды, ещё некоторые клетки могут начать мутировать. Учитывая эти моменты, многие лаборатории, особенно молодые, делают запас в 10–20 процентов от необходимого количества растений.

Этап 6. Специализация клеток растения

В зависимости от выбранного метода микроклонального размножения проводится этап специализации клеток. За счёт гормонов и состава питательной среды неспециализированной клеточной ткани даётся команда на образование побегов и корневой системы. Часто это происходит на разных питательных средах, так что тут может потребоваться ещё один перенос, опять-таки в стерильных условиях.

Многие лаборатории создают банки размножаемого материала. Для этого полученные растения или клеточную ткань помещают в холодильники и хранят при определённых условиях. Таким образом, мы в любой момент довольно быстро можем запустить новый цикл микроклонального размножения растений. Стоит сказать, что микроклональный способ размножения растений имеет свои ограничения. По неизученным до конца причинам культура клеток начинает деградировать спустя 30–50 циклов деления, увеличивается количество мутаций, либо клеточная культура погибает, так что всегда полезно иметь в запасе первично полученную культуру клеток материнского растения.

В зависимости от выбранного цикла производства на этом этапе уже можно остановиться. В наших контейнерах на питательной среде уже растут полноценные клоны растения, имеющие стебелёк, листья и корешки. Если мы создадим определённые условия (температурный режим, короткий цикл и особый спектр освещения), то клоны в контейнерах на питательной среде могут жить до полугода (обычно их не держат больше двух-трёх месяцев). Лично я держал клоны карельской берёзы в условиях обычной квартиры около четырёх месяцев без особого ущерба для них. И только по прошествии этого времени перенёс их в грунт. Перенос в грунт — финальный этап микроклонального размножения.

Этап 7. Перенос клонов растений в субстрат

Это финальный этап технологии микроклонального размножения. Как и другие этапы, он требует определённых навыков. Моя первая попытка простого пересаживания клонов в грунт привела к их стопроцентной гибели. Растения в контейнере стерильны. Они очень нежные и не знают не то что ветра, но и даже небольших колебаний воздуха. Влажность внутри контейнера стремится к 100 процентам. Для растений их перенос в субстрат — очень большой стресс, и по возможности этот стресс нужно минимизировать.

Растения можно переносить не только в грунт, но и на минеральную вату или в гидропонные системы. Если речь идёт про грунт, то сначала растения высаживаются в рассадные кассеты со стерильной почвой, оставляются на некоторое время в помещении или теплице, а далее постепенно адаптируются к открытому грунту. В отдельном материале я подробно опишу инструкцию для этого этапа.

Можно выделить ещё один важный этап — реализацию посадочного материала, но это уже скорее про коммерцию и маркетинг.

Надеюсь, мне удалось рассказать простым языком об этапах микроклонального размножения. В следующих статьях я постараюсь углубиться в особенности этой технологии с более подробным описанием каждого этапа. Задавайте вопросы, пишите комментарии, я всегда открыт к диалогу. Всем больших урожаев!

Поделись
0 0 голоса
Рейтинг статьи
Подписаться
Уведомить о
guest
2 комментариев
Старые
Новые Популярные
Межтекстовые Отзывы
Посмотреть все комментарии
Тюрюковка
3 месяцев назад

Интересный материал, посиб. Расскажите как сделать питательный раствор для клонирования в домашних условиях и вообще интересен весь подробный процесс микроклонирования.